Phenylによるタンパク質の精製
~疎水カラムクロマト~

phenylの再生



1.ブフナーロートに円形ろ紙をセットし水を入れアスピレータで引く。
   
2.ブフナーロートにPhenyl 50mlを入れ、0.1N NaOH 500mlを通す。
   常にNaOHで満たし、Phenylが乾かないように注意する。
3.次にH2OをpHが中性になるまで通す。
   pH試験紙を使用。
4.0.1N HCl 500mlを通す。
   
5.再びH2OをpHが中性になるまで通す。
   
6.最後にA液 100mlを通し、Phenylを薬さじなどでビーカーに移す。
   

7.ビーカーにA液を入れガラス棒で混合後、静置しPhenylが沈殿したら上清を除く。
   デカンテーションで除く。この操作を4、5回繰り返す。


カラムの平衡化



1.カラムを用意し、中に円形に切り取ったろ紙を入れる。
   
2.H2Oを落としカラムの下部からPhenylが落ちないように蓋をする。
   
3.H2O 20mlをカラムに入れ、20mlの位置にラインを記入しておく。
   
4.H2Oを抜き、同時にPhenylを20mlラインまでピペットで静かに入れる。
   沈殿するのを待ちながら20mlラインに達するまで入れる。
5.上部にチューブの出ている蓋をし、カラムよりも上の位置にA液 500mlのビーカーを置く。
   
6.A液を0.5滴/sec程度の速さで入れる。
   カラムに常にBufferが満たされているように注意。
7.500ml流れ終わったら平衡化終了。一応pHを確かめておく。
   


サンプルの精製



1.サンプルに等量のC液を混合。ammonium sulfate濃度をカラムと同じにする。
   
2.、平衡化のときと同様の手順でカラムに通す。
   目的のタンパク質がカラムを素通りすることもあるので滴下した液も保存する。
3.A液を40ml程度流しチューブに溜まっているサンプルもカラムに落とし込む。
   
4.カラム中のBufferを枯れない程度に少なくし、A液とB液の各100mlでのammonium sulfate勾配溶液を滴下する。
   A液とB液をチューブでつなぎ、A液にスターラーとカラムへのチューブを通す。
4.ammonium sulfate勾配に応じてタンパク質が溶出するのでフラクションコレクターなどを用いて回収する。
   UVディテクターを併用すると検出が簡単になる。
5.勾配が終わったらB液を100ml程度流し洗う。
   
6.各分画をSDS-PAGEなどにより調べる。
   


溶液の調製


【A液】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  1mM EDTA
  1mM DTT
  10% glycerol
  27.5% ammonium sulfate
  H2O

    1M EDTA		1ml
    KPi Buffer		50ml
    glycerol		100g
    DTT		154mg
    H2O		total 1000ml
    ammonium sulfate	160g(1000ml溶液に対して入れる)




【B液】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  1mM EDTA
  1mM DTT
  10% glycerol
  H2O


    1M EDTA		1ml
    KPi Buffer		50ml
    glycerol		100g
    DTT		154mg
    H2O		total 1000ml

  ※A液からammonium sulfateを除いた溶液がB液


【C液】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  1mM EDTA
  1mM DTT
  10% glycerol
  55% ammonium sulfate
  H2O

    1M EDTA		1ml
    KPi Buffer		50ml
    glycerol		100g
    DTT		154mg
    H2O		total 1000ml
    ammonium sulfate	351g(1000ml溶液に対して入れる)

  ※A液のammonium sulfate濃度を2倍にした溶液がC液

硫安添加量と濃度



10%  20%  25%  30%  33%  35%  40%  45%  50%  55%  60%  65%  70%  75%  80%  90% 100%
56g 114g 144g 176g 196g 209g 243g 277g 313g 351g 390g 430g 472g 516g 561g 662g 767g

  ※30%硫安溶液を作りたいときは、1000mlの溶液に対し176gのammonium sulfateを加える。
   totalで1000mlにするのではないことに注意。溶液は1000ml+αの容量となる。

  ※100%硫安溶液は4.1~4.2M ammonium sulfateに相当する。


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