P-Cellによるタンパク質の精製
~phospho cellulose column~

1.菌体20gをガラスのビーカーに取り、100ml TEMSに懸濁。
   氷中に置く。
2.レベル9、Duty50%、15min程度sonication処理。
   氷中で処理。
   ガラス製の容器でやった方が効くらしい。
   溶液がサラサラ(粘性なし)になるまで処理する。
3.5% Brij58 10mlを加える。
   Brij58は溶けにくいのであらかじめファルコンチューブで作っておく。
   溶かすときは湯煎を使うといい。
4.4℃、40min静置。
   
5.4℃、18000rpm、60minで遠心。上清を保存。
   
6.上清100mlに400ml C液を加え5倍希釈。
   A液やB液との違いはKClが含まれていない点。
7.サンプルとして冷所保存。
   



1.ブフナーロートに円形ろ紙をセットし水を入れアスピレータで引く。
   
2.ブフナーロートにP-Cell 50mlを入れ、0.1N NaOH 500mlを通す。
   常にNaOHで満たし、P-Cellが乾かないように注意する。
3.次にH2OをpHが中性になるまで通す。
   pH試験紙を使用。
4.0.1N HCl 500mlを通す。
   
5.再びH2OをpHが中性になるまで通す。
   
6.最後にA液 100mlを通し、P-Cellを薬さじなどでビーカーに移す。
   
7.ビーカーにA液を入れガラス棒で混合後、静置しP-Cellが沈殿したら上清を除く。
   デカンテーションで除く。この操作を4、5回繰り返す。



1.カラムを用意し、中に円形に切り取ったろ紙を入れる。
   
2.H2Oを落としカラムの下部からP-Cellが落ちないように蓋をする。
   
3.H2O 20mlをカラムに入れ、20mlの位置にラインを記入しておく。
   
4.H2Oを抜き、同時にP-Cellを20mlラインまでピペットで静かに入れる。
   沈殿するのを待ちながら20mlラインに達するまで入れる。
5.上部にチューブの出ている蓋をし、カラムよりも上の位置にA液 500mlのビーカーを置く。
   
6.A液を0.5滴/sec程度の速さで入れる。
   カラムに常にBufferが満たされているように注意。
7.500ml流れ終わったら平衡化終了。一応pHを確かめておく。
   



1.サンプルを全量、平衡化のときと同様の手順でカラムに通す。
   目的のタンパク質がカラムを素通りすることもあるので滴下した液も保存する。
2.A液を40ml程度流しチューブに溜まっているサンプルもカラムに落とし込む。
   
3.カラム中のBufferを枯れない程度に少なくし、A液とB液の各100mlでのKCl勾配溶液を滴下する。
   A液とB液をチューブでつなぎ、A液にスターラーとカラムへのチューブを通す。
4.KCl勾配に応じてタンパク質が溶出するのでフラクションコレクターなどを用いて回収する。
   UVディテクターを併用すると検出が簡単になる。
5.勾配が終わったらB液を100ml程度流し洗う。
   
6.各分画をSDS-PAGEなどにより調べる。
   





【TEMS】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  5mM EDTA
  1mM DTT
  H2O

    1M EDTA		50μl
    KPi Buffer		500μl
    sucrose		25g
    DTT		15.4mg
    H2O		total 100ml



【A液】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  1mM EDTA
  1mM DTT
  10% glycerol
  0.1M KCl
  H2O

    1M EDTA		1ml
    KPi Buffer		50ml
    KCl		7.5g
    glycerol		100g
    DTT		154mg
    H2O		total 1000ml




【B液】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  1mM EDTA
  1mM DTT
  10% glycerol
  1.0M KCl
  H2O

    1M EDTA		1ml
    KPi Buffer		50ml
    KCl		75g
    glycerol		100g
    DTT		154mg
    H2O		total 1000ml


【C液】
  50mM KPi Buffer(pH7.5)
  1mM EDTA
  1mM DTT
  10% glycerol
  H2O








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