レビュー:核とミトコンドリアにおける酸化傷害修復機構

 活性酸素種(reactive oxygen species; ROS)は細胞代謝の中で生じる。ROSはタンパク質 、脂質、DNAなどと反応する。DNAと反応するとAPサイトの生成、糖の傷害、塩基修飾、DNA鎖 切断などを生じる。このレビューでは塩基除去修復(base excision repair; BER)とヌクレ オチド除去修復(nucleotide excision repair; NER)に注目し、哺乳類での修復系について ミトコンドリアにおける修復も交え紹介する。



【酸化傷害】
 ROSによるDNA酸化傷害として100種類以上が知られている。その中で最も安定な傷害塩基と して8-hydroxyguanine(8-oxoG)が知られる。
 DNA酸化傷害はガン化、老化、神経性退化などに関与していると考えられている。肺ガン細 胞では酸化傷害塩基の蓄積が見られることや、咽頭ガン細胞に8-OG、8-OA、Fapyなどが正常 細胞に比べ9倍以上含まれていたこと、加齢と共に8-OGが増加することやアルツハイマー病患 者の脳細胞で酸化傷害が多く検出されることなどが報告されている。
 酸化傷害の実験系では、各種酸化傷害を生成する過酸化水素、塩基傷害だけでなくDNA鎖切 断も引き起こす放射線照射、1O2による傷害を生じるメチレンブルー +可視光、thymine glycol(TG)を生じるosmium tetroxideなど多種類が用いられている。ま た酸化傷害の検出方法も多くのが知られ、検出方法の差異により結果も左右される。
 例えばUV照射によるphotoproductがアクティブな遺伝子上にあるか、それとも不活性化され ている遺伝子上にあるかにより傷害の影響が変わることが知られている。この例のように、酸 化傷害がゲノム上のどこに位置しているかを調べることもまた重要である。
 各種DNA修復系酵素の検定に用いられている遺伝子特異的修復検定(gene-specific repair assay; GSR)により、EndoIIIが酸化ピリミジンの認識を効率よく行なうゲノム位置や、Fpg glycosylaseが酸化プリンに反応しやすい遺伝子が見つかっている。

【酸化傷害の塩基除去修復】
 BERはDNA glycosylaseにより、糖と塩基の間のN-glycosylic bondの開裂から始まる。glycosylase には、glycosylase活性だけを持つ酵素と、glycosylase活性に加えAP lyase活性を持つ酵素の 2つのタイプがある。AP lyase活性はglycosylaseに続いて行なわれ、DNA主鎖の切断を担う。 glycosylaseの次にはAP endonucleaseが続く。AP endonucleaseはAPサイトの3'-deoxyriboseを 除去し、DNA polymeraseが必要とする3'-OHを生成する。続いてDNA polymeraseが塩基を重合 し、DNA ligaseがDNA主鎖を結合する。

・8-OGの修復
 8-OGは複製過程でadenineとミスマッチを形成し、G→T transversionを引き起こす。細菌は この8-OGのBER修復系酵素として8-OG DNA glycosylase/AP lyaseであるMutM(Fpg)やadenine DNA glycosylaseであるMutY、8-oxodGTPaseとしてMutTを持つ。真核生物でもこれらの修復系 酵素のホモログが見つかっている。
 酵母ではアミノ酸配列上のホモロジーはないものの機能的にMutMのホモログであるyOgg1が 同定されている。yOgg1は8-OGと対を形成しているピリミジン、APサイト、FapyGに作用し、 β-eliminationによりDNA鎖を開裂する。
 E. coliのMutM、MutY欠損株にyOgg1のヒトでのホモログhOgg1を発現させると変異率 が減少することが報告されている。hOgg1はOG:Cを基質として好みβ-eliminationによりDNAを 開裂する。Ogg1にはHelix-hairpin-Helix(HhH)やGly/Pro-rich-Asp(GPD)といった保存さ れたモチーフがある。また、C2H2 zinc finger-likeモチーフも有す る。ogg1遺伝子のアラインメントからDNA修復酵素群のスーパーファミリーも提唱され ている。
 酵母においてOG:Gを基質として好むOgg2も見つかっている。これは以前から知られている酵 母のFapy DNA glycosylaseと基質特異性が似通っている。これらが同じ酵素なのかは不明であ る。また、ヒトからは8-OG DNA glycosylase活性は持つがFapyGとは反応しないMg依存性酵素が 見つかっている。ほかにもHeLa細胞から8-OG glycosylaseと8-OG endonucleaseが見つかってい る。これらはOgg1と同様の基質特異性を示しているが、Ogg1ホモログかそれとも新規酵素であ るかは分かっていない。
 複製の際、DNA polymeraseによって8-OGの反対側に取り込まれるAdenineを除去するadenine glycosylaseとしてE. coliでMutYが知られている。この酵素のヒトでのホモログMYHも 同定されており、A:G、A:OG、A:CからAdenineを除去する。MYHはAP lyase活性も有する。
 細胞内ではdeoxyribonucleotide poolも酸化傷害の危険性にさらされている。dGTPは酸化に より8-oxodGTPとなり、複製の際にDNAに取り込まれAdenineと対を形成する。これを防ぐため、 8-oxodGTPaseであるMutTが存在し8-oxodGMPに加水分解する。

・TG、飽和環ピリミジンの修復
 8-OG以外の酸化傷害としてthymine glycol(TG)が知られる。TGは8-OGと異なりDNA/RNA polymeraseによる核酸重合反応が止まるため致死的傷害である。細菌ではこのTGを認識し除去 する修復酵素としてEndoIIIが知られている。しかしながら、EndoIII欠損株でもH2 O2やX線に対し感受性が著しく大きくなることはない。これに対応し、同様な活性 を持つEndoVIIIが細菌に存在する。加えて、UvrABCがTGを認識することや、酵母ではNTG1( endonuclease three-like glycosylase 1)もクローニングされている。NTG1はユニークな基質 特異性を持ち、酸化プリンだけでなくFapyGにも活性を持つ。しかしながらこの酵素は8-OGには 活性を持たない。酵母でのNTG1欠損株はH2O2やmenadioneに感受性を 示す。
 哺乳類でのTG glycosylaseはcalf thymusや牛の細胞から精製されている。また、EndoIIIホ モログも同定されている。ヒトのEndo IIIホモログはureaとTGに働き、鉄-硫黄クラスターや Helix-hairpin-Helixモチーフを持つ。

・APサイト、糖傷害の修復
 APサイト(apurinic or apyrimidinic site; abasic site)はDNAのN-glycosylic bondの偶 発的な加水分解、酸化傷害、DNA glycosylaseなどにより生じる。AP endonuclaseはこのAPサイ トから3'-OHを生成する。ヒトでのAP endonucleaseとしてHAP1(APE; APEX; Ref-1)が知られ ている。この酵素はAPサイトの5'側を切断し、5'-deoxyribose moietyと3'-OH基を生成する。 AP endonuclease活性に加え3'-phosphatase、3'-phosphodiesterase、弱いexonuclease活性を も有する。
 AP endonucleaseはAPサイト修復系の主経路に位置する。しかしながら、NER系の役割も大き い。E. coliではC4'やC1'が酸化した酸化APサイト はendonucleaseであまり認識され ない。哺乳類でのHAP1もこれと同様の基質特異性を示すことは興味深い事実である。ほかの修 復経路がこの酸化APサイトの修復を担っているのだろうか?NERが修復を担っているのだろうか?

【酸化傷害のヌクレオチド除去修復系】
 細菌と哺乳類では酸化傷害の修復はBER、NERの2つの系で行なわれることが知られている。 NERでは損傷部位除去のため複数の酵素複合体が使われている。NERはglobal repair element とTCR機構(transcription-coupled repair mechanism)という2つの要素から成っている。 転写的に活性化されている遺伝子はそうでない部位よりも修復速度が速い。この転写と共役 した複製はtranscription factorであるTFIIHが基盤となっている。NER欠損症としてxeroderma pigmentosum(XP)、Cockayne's syndrome(CS)、trichothiodystropyの3つが知られてい る。
 XP患者は太陽光線に感受性であり若年層でガンとなることが多い。XPには7種類の分類があ り、XPとXP/CSグループとで神経性異常に発展する。酸化傷害の修復系とこの神経異常のタイ プの関係が研究されている。XP-A細胞で1O2処理を行なったDNAを基質 として正常細胞との活性を比較したが相違はなかった。同様にUV処理を行なったDNAを基質と したところ、感受性が著しく高くなっていた。このことからXP-A細胞では1O2 傷害修復系は正常であり、また神経性異常1O2傷害には直接の作用は ないと考えられる。
 XP細胞では1O2に起因しない酸化傷害が影響を及ぼしていると考え られる。このことを確かめるため、γ線照射やH2O2処理を行なった DNAをEndoIIIとFpgで処理することで主要な酸化傷害を除去したものを基質として用いXP-A、 XP-B、XP-C、XP-D、XP-Gで活性の差異を検定した。結果、全てのXP細胞で修復活性の低下が 見られ、purine dimerのように酸化傷害の量的には小さいものの主にNERで修復される傷害が 蓄積し、このことにより異常が生じていると考えられている。
 CS患者はdwarfism、premature aging、太陽光線感受性、精神退行などの特徴がある。XPと CSの双方を併せ持つ患者はXPグループ(XP-B、XP-D、XP-G)に分類される。CS細胞は活性化 遺伝子の修復系とUV誘導型pyrimidine dimerのTCR修復系を欠損している。CSはCS-AとCS-Bの 2つに分類される。これらを担うCSAおよびCSB遺伝子が同定されているが、こ れらとTCRとの関係は未だ分かっていない。最近CSBタンパク質が転写反応に直接的関わりを持 つことが見つかっている。
 CSA、CSBとXP-A細胞において放射線によるイオン化への感受性やこれによる傷害に起きるTCR が調べられている。CS-AとCS-B細胞はγ線感受性を示した。抗体を用いた遺伝子特異的修復系 の検定ではCS-AとCS-B細胞は10 grayのγ線で修復が見られなかった。同様にTCR機構で修復さ れるTGの修復がCS-BおよびXP-G/CS細胞で欠損していることも見つかっている。XP-A、XP-F、XP-G 細胞でのTCRによるTGの修復系は正常であることが分かっている。このことからも酸化傷害が TCRで修復されないのはNERの欠損が原因であること、NERによらないTCR修復系が存在すること が示唆される。
 UV照射に続いて起きるTCRなどの研究も多く行なわれているが、こられから酸化傷害のTCRに よる修復に関する情報はあまり得られない。UV誘導pyrimidine dimerはnuclear matrixから始 まることが知られている。このことは酸化傷害修復系の組織化に関する興味深い知見を与える かもしれない。

【ミトコンドリアにおけるDNA傷害修復】
 一般的にROSはミトコンドリアでの酸化的リン酸化によって生じると考えられていることから ミトコンドリア内での酸化傷害修復機構には興味が尽かない。mtDNAは核のDNAよりも酸化傷害 の蓄積が大きいことが知られている。mtDNAがより多くの酸化傷害にさらされているのでミトコ ンドリアではより活性が高い酸化傷害修復機構を必要としていると考えられる。
 核DNAよりmtDNAは10倍の8-OGが存在することが報告されているが、ミトコンドリア内に存在す る8-OGの量について議論が生じている。それは加齢の影響、酵素的検出法かHPLC法か、精製方法 をどのようなものにするか、細胞株は何を用いるかなどによって異なるからである。これらの相 違を考慮に入れた上で傷害の傾向をつかむ必要がある。
 mtDNAにおけるUV誘導pyrimidine dimer修復系の欠損は古くから知られている。このことから mtDNAにはDNA修復系が存在しないと言われてきた。しかしながら、最近修復系の存在が知られて きた。
 ミトコンドリアは酸化傷害修復系を有することが見つかっている。これにはGSR assayが用い られた。この方法ではmtDNAを分離する必要がない。細菌における修復酵素を用い酸化傷害を検 出し核DNAでの傷害との比較を行なった。strand biasやTCRといった方法もまた検定に用いた。
 GSR assayを用いることでDNA鎖切断修復、アルカリ感受性部位や多くの傷害が検出された。近 年、EndoIIIやFpgのアルカリ下がアルカリだけのときとで傷害率が異なることが報告されている。 これらは主にAPサイトかDNA鎖切断を検出していると考えられる。このことと、ミトコンドリア からAP endonucleaseが部分的に精製されたことなどからmtDNAではAPサイトが効率的に修復され ていると考えられる。
 Fpgで認識しうる酸化傷害はmtDNAで修復されることがratやChinese hamster細胞の実験によって 明らかになっている。この実験ではacridine orangeと光により酸化傷害を精製し、GSR assayには Fpgを用いた。acridine orangeと光で誘導される酸化傷害はmtDNA、核DNAのどちらでも修復され た。約65%の傷害が4時間で修復された。この速度は核のdihydrofolate reductaseと同じかこれよ りも速いぐらいである。Fpg感受性傷害の効率的な修復はミトコンドリアにBER修復系があること を示唆している。最近rat肝細胞のミトコンドリアから8-OG DNA glycosylase活性が部分的に検出 されている。
 ポリメラーゼ伸長検定によりH2O2傷害の誘導と修復が検定されている。 この検定法では特異的な傷害を見ることはできないが、どのような傷害がポリメラーゼ反応を停 止するかが分かる。軽いH2O2処理を行なった場合にはmtDNAの方が核DNA よりも修復活性が高い。しかしながら高レベルのH2O2処理を行なうと ミトコンドリアでは3.5時間まで修復活性が見られなかった。
 最近までmtDNAにおけるNER系のin vitroにおける検出方法が確立されていなかった。あ る報告では、H2O2処理を行なったプラスミドにミトコンドリア抽出液を 反応させている。更なる検出系の確立も必要である。
 興味深いことに組換え修復系で処理されると考えられている複合的な傷害、cisplatin interstrand cross-linksがmtDNAで修復されることが報告されている。このことはミトコンドリアもまた組換 え修復系を持っていることを示唆している。最近、ミトコンドリア抽出液とプラスミドを反応さ せることによるrecombination検出系が報告されている。ほかにも4-nitroquinoline DNA傷害とい った複合傷害の除去も見つかっている。4-nitroquinoline DNA傷害は一般的にNER系で修復される と考えられている。しかしながら、NERはミトコンドリアには存在しないと考えられている。どの ようなNER系酵素が修復を担っているのかは不明である。
 加えてミトコンドリアはMutTホモログも有する。ミトコンドリアで複製に関わるポリメラーゼγ は8-OGをadenineの反対側に多く取り込む。これを避けるためミトコンドリアは独自のMutTホモロ グを持ち、8-oxodGTPを8-oxodGMPに加水分解している。
 いくつかの異なった方法からミトコンドリアは酸化DNA傷害の除去能力を有することが明らかで ある。しかしながら、ミトコンドリアで働いている酵素が核でのそれと同じモノかどうかはまだ 分かっていない。

【結論】
 DNAはROSによりコンスタントに固有の不安定な酸化傷害を蓄積している。DNAゲノムの維持の ため、核とミトコンドリアの両方で効率的な修復機構が用意され酸化傷害を取り除いている。酸 化傷害の修復は細菌でよく研究されているが真核生物ではまだ知見が少ない。
 ミトコンドリアもDNA修復機構を有している。DNA鎖切断や8-OGなどいくつかの酸化傷害の修復 が行なわれている。ミトコンドリアにおけるDNA修復機構の研究はこれからの重要な課題である。
 DNA酸化傷害修復に関する研究は進歩が非常に速い。BER、NERやほかの修復機構の寄与が明らか になりつつある。哺乳類では100種類以上のDNA修飾傷害が知られている。そしてこれらは個々に もしくはいくつかがまとまってDNA中に蓄積し病気などを引き起こしていると考えられている。


≪文献≫
The Journal of Biological Chemistry, 1997, Vol.272, No.41 25409-25412
Repair of Oxidative Damage to Nuclear and Mitochondrial DNA in Mammalian Cells
Deborah L. Croteau, Vilhelm A. Bohr

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