APサイトのaldehyde基と反応する蛍光試薬FARP（fluorescent aldehyde-reactive probe）
を用いAPサイトの高感度検出を行なう。
ビオチンラベルしたDNAをプレートに固定化、それにFARPを反応させる。実際に測定するとき は基質として用いるDNAにもともと含まれるaldehyde基の存在が問題になる。このaldehyde基の 除去はhydroxyl amine処理で行なう。hydroxyl amine処理の後にMutYなどのDNA glycosylase等 を反応、APサイト生成反応を行ないFARPによる蛍光検出をする。
FARP（fluorescent aldehyde-reactive probe）
[5-(((2-(carbonhydrazino)-methyl) thio) acetyl)-amino-fluorescein, aminooxyacetyl hydrazide]
この検出方法を用い、plasmid DNAを37℃に置いたときのAPサイト生成を測定した。結果、 ～1.7APサイト/106nucleotide/dayの割合で生じることが分かった。この結果は 以前に報告されているヒト細胞での生成率9000APサイト/cell/dayとほぼ一致している。
≪文献≫
Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.5 1316-1322
Novel non-isotopic detection of MutY enzyme-recognized mismatches in DNA via ultrasensitive detection of aldehydes
Gautam Maulik, Stanley Botchway, Subrata Chakrabarti, Sotirios Tetradis, Brendan Price, G. Mike Makrigiorgos
ビオチンラベルしたDNAをプレートに固定化、それにFARPを反応させる。実際に測定するとき は基質として用いるDNAにもともと含まれるaldehyde基の存在が問題になる。このaldehyde基の 除去はhydroxyl amine処理で行なう。hydroxyl amine処理の後にMutYなどのDNA glycosylase等 を反応、APサイト生成反応を行ないFARPによる蛍光検出をする。
FARP（fluorescent aldehyde-reactive probe）
[5-(((2-(carbonhydrazino)-methyl) thio) acetyl)-amino-fluorescein, aminooxyacetyl hydrazide]
この検出方法を用い、plasmid DNAを37℃に置いたときのAPサイト生成を測定した。結果、 ～1.7APサイト/106nucleotide/dayの割合で生じることが分かった。この結果は 以前に報告されているヒト細胞での生成率9000APサイト/cell/dayとほぼ一致している。
≪文献≫
Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.5 1316-1322
Novel non-isotopic detection of MutY enzyme-recognized mismatches in DNA via ultrasensitive detection of aldehydes
Gautam Maulik, Stanley Botchway, Subrata Chakrabarti, Sotirios Tetradis, Brendan Price, G. Mike Makrigiorgos