プラスミドの回収
~ DNA Minipreparation ~

1.OverNightで培養した菌の1.5mlをエッペンで遠心(15,000rpm×3min)。
   2.0ml テリフィック培地で培養するといいかも。
   遠心後、エッペンをペーパータオルにひっくり返して上澄みを捨てる。
2.沈殿をGTE 100μlでVortex。氷中に置く。
   
3.作りたてのアルカリSDS溶液200μlを加え上下にゆっくりひっくり返す。
   激しく攪拌するとゲノムDNAが出てしまう。
4.氷中に5min置く
   正確に5分間置くこと!!
5.7.5M NH4Ac 150μlで中和しVortex。
   
6.4℃15,000rpm×10minで遠心。上澄みを新しいエッペンに移す。
   新しいエッペンを用意しマジックで印などをつけておく。
7.isopropanol 300μlを加える。
   飽和溶液にするため3層に分かれている場合は1番上を使う。
8.常温で10分待つ。
   待ってる間に遠心機の温度を調節しておく。
9.常温15,000rpm×10minで遠心。上澄みを捨てる。
   
10.冷80%エタノール1000μlを加え軽く攪拌。
   
11.4℃15,000rpm×10minで遠心。上澄みを捨てる。
   ピペットで捨てる。
12.遠心エバポレータで乾燥。
   15~30分まわせば乾く。
13.TE 50μlを混合。
   プラスミドの挿入テストや形質転換に使う。

【GTE溶液】
  1M Tris HCl(pH7.6)	2.5ml
  0.5M EDTA(pH8.0)		2.0ml
  20% glucose			4.5ml
  H2O				total 100ml


【アルカリSDS溶液】
  NaOH(1粒)			0.1g
  SDS				0.1g
  H2O				total 10ml
   ※作るときはファルコンチューブを2本用意し、片方にはNaOHとH2O 1ml
    もう片方にはSDSとH2O 9mlを入れ使う前に混合する。




 大事なことはSDSを入れてから中和するまで。この間に激しい操作を行なったり、温度を上げたりしないこと。そうすればOk。


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