DNAの制限酵素処理

でDNAが制限酵素 により切断されたことを確認する。反応溶液の1μlを泳動する。

反応溶液


  ×10 Buffer			1.0μl
  DNA sample			3μl
  制限酵素			0.5μl
  H2O				total 10μl

   ※ H2Oはオートクレーブ済みの滅菌水を用いる。
   ※ Bufferは使用する制限酵素に最適なものを用いる(下記参照)。
   ※ DNA sampleは反応後に電気泳動したバンドを見て増減する。つまり複数回反応を行なう。

Bufferの選択


 制限酵素によってその最適反応条件が異なる。制限酵素はその反応Bufferと組で販売され ている。反応時にはその制限酵素に最適なバッファーを用いる。
 例えばEcoR IにはNaClが高濃度なH bufferが添付されている。そのため反応時にはこのバ ッファーを使う。もしNaClが含まれていないL Bufferを用いると切断活性が20%程度まで減少 するとともにスター活性が生じる。すなわち、 本来の認識配列であるGAATTCに特異的切断活性を示すだけでなくAATTという配列のみを認識 して切断するようになる。
 ただし注意が必要な場合がある。それは2種類以上の制限酵素で同時に切断する場合である。 この場合には2つの酵素の各種バッファーに対する反応の変化をカタログで調べ最適なものを 自分で選択する。例えばH Bufferが添付されているEcoR IとM BufferのHind IIIで同時に反 応を行なう場合にH Bufferを使うとHind IIIの活性が80%以上低下するのでM Bufferを用いる。
 2種以上の制限酵素で反応させる場合でどうしても最適なバッファーが選べない場合には、 1種類の酵素を反応させたのち、反応溶液中のDNAを1度エタノール沈殿 しバッファーを入れ替える。
 またバッファーは「×10」という形で用意されている。これは「10倍濃度のバッファー」の 意であり、反応溶液に対して10分の1容量・・・反応溶液が全量で10μlの場合は1μlの×10 bufferを使う・・・ということを示している。


反応溶液調製と反応


 マイクロプレートを用意し、
1.H2O
2.×10 Buffer
3.DNA sample
の順に調製する。制限酵素は最後に入れる。制限酵素は熱に弱いためたいてい-20℃の 冷凍庫に保存されている。制限酵素を入れる操作は冷凍庫のそばで行ない、保存されて いる酵素を外気にさらす時間を極力短くする。
 反応は37℃の培養機で数十分から数時間行なう。全量で10μlと微量で乾燥しやすいの で湿らせたキムワイプをマイクロプレートの蓋に挟み込むように入れておく。


反応生成物の確認


 アガロースゲル電気泳動

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