DNAのPCR


【反応溶液】
  DNA sample			1.0μl
  100pM primer		1.0μl×2
  2.5mM dNTP			5.0μl
  ×10 Buffer(MgCl2入)	5.0μl
  H2O				total 50μl

   ※ H2Oはオートクレーブ済みの滅菌水を用いる。
   ※ BufferにMgCl2が含まれていない場合には終濃度1.5mMになるように加える
   ※ ミネラルオイル50μlを上に入れ反応中に蒸発しないようにする
   ※ Taq polymeraseは反応開始後に0.5μl入れる(下記参照)


【反応溶液 6回分】
  DNA sample			6.0μl
  100μM primer		1.5μl×2
  2.5mM dNTP			30μl
  ×10 Buffer(MgCl2入)	30μl
  H2O				total 300μl(231μl)

   ※ primerとなる合成オリゴDNAは100μMでストックすることが多いためこの調製法が便利
   ※ 6本に分注後ミネラルオイル50μlを上に入れ反応中に蒸発しないようにする


【反応温度】
  95℃	5min

  95℃	2min
  65℃	1min(勾配2min)
  72℃	1min(勾配1min)	30サイクル

  72℃	10min
   4℃

   ※ 65℃という温度はアニーリング温度でありprimerによって異なる

【反応溶液調製と反応】
 200μlエッペンを用意し、
1.H2O
2.×10 Buffer
3.dNTP
4.DNA sample
5.primer
の順に調製する。サーマルサイクラーに温度変化プログラムをセットし反応を開始する。 一番初めの95℃5minが終わった時点でサーマルサイクラーの温度変化を一時停止する。そ してエッペンを取り出し、Taq polymeraseの0.5μlをエッペンの壁面に付ける、遠心する ことで反応液中に酵素を添加する。再びエッペンをサーマルサイクラーに入れプログラム を再開する。


【PCR反応後処理】
 目的の断片が増幅されているかどうか電気泳動により調べる。その際、ミネラルオイル があるとサンプルがゲルにアプライできないので、まずはミネラルオイルを除去する。
 PCR反応後のエッペンは2層に分かれ上層がミネラルオイルとなっている。下層をオイル が混入しないようにピペットで取り、パラフィルムにのせる。パラフィルム上で溶液をこ ぼさないように転がすとオイルはパラフィルムに付着し完全に除去できる。パラフィルム からエッペンに溶液を移す。
 電気泳動をしてみる。アプライ量は反応溶 液の1μlで十分。もしもバンドが見えなかった場合にはアニーリング温度を低くする。逆 に複数のバンドが見える場合にはアニーリング濃度を高くする。
 目的の長さのバンドが見えた場合には、更に制限酵素で切断して目的の断片であること をきちんと確認する。制限酵素は目的のDNAを1分割もしくは2分割するものを用い、2断片 化もしくは3断片化することを確認する。制限酵素反応溶液は全量で10μl、DNA量は1μlで 制限酵素反応を行ない、2μl程度を電 気泳動する。

 目的のDNA断片が増幅されていることを確認したら、反応溶液の全量を フェノクロ処理および エタノール沈殿処理し、10μl TEもしくは次の 処理に必要なバッファーに溶解する。



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