タンパク質の泳動

1.□ガラス板の溝が広いほうを下にし、パッキングを間に凹ガラス板をクリップで挟む。
   凹ガラス板は凹み部分傾斜が内側を向くようにする。
   ガラス板はエタノールで濡らしてキムワイプで拭くといいかも。
2.冷蔵庫で冷やした試薬一式を用意する。
   APSとTEMEDは氷中に置く。
3.Separation Gelをファルコンチューブに作る。
   APSとTEMEDは最後に混合。
4.長さが約6cmになるようにSeparation Gelを流し込む。
   ファルコンチューブを並べてラベル下部ぐらいの位置まで流し入れる。
   注射器みたいなのを使うこともあるけど、ファルコンチューブで直接流して構わない。
5.流しいれたら界面が酸化しないようにbutanolを1mmぐらい流し入れる。
   本当は駄目なんだけどethanolで代用してもいい。
6.固まるまで根気良く待つ。
   あまったSeparation Gel溶液がファルコンチューブ内で固まるまで待つといいかも。
7.Stacking Gelをファルコンチューブに作る。
   APSとTEMEDは最後に混合。
8.界面に入れたbutanolを捨て、H2Oで軽く洗浄。
   ペーパータオルを突っ込んでしみ込ませて軽く乾かす。
9.Stacking Gelを流し込む。
   注射器みたいなのを使うこともあるけど、ファルコンチューブで直接流して構わない。
10.気泡が入らないように注意しながらコームを挿す。
   
11.固まるまで待つ。
   
12.ゲルからクリップを取り、パッキングをはずす。
   ゲルの底面が汚かったらペーパータオルで平らにする。
13.泳動槽に作成したゲル板をセットする。
   
14.Running Bufferを泳動槽に満たす。
   
15.サンプルを注射器でレーンに打つ。
   サンプルがコンタミしないように毎回泳動槽内で注射器を洗浄する。
   未使用のレーンがあるとうまく流れないことがあるのでDyeのみを打っておく。
16.20mA(定電流)で泳動する。
   Separation Gelに入ったら40mAにしてもいい。
17.TOPがBuffer中に流れ出るぐらいまで泳動する。
   
18.ゲルを取り出し水洗。
   
19.タッパーに染色液と共に入れラップをして電子レンジで1分間加熱。
   
20.水洗し脱色液を入れ、上にキムワイプを載せてラップをかけ電子レンジで加熱。
   脱色液が沸騰しない程度過熱。水洗と脱色を繰り返す。
   脱色には時間がかかるので脱色液に浸したままシェーカーに置いておく。
21.機械で見るときは水洗しラップの上にゲルを載せて白熱灯で見る。
   


【Separation Gel 7.5%】
  30% acrylamide		1.5ml
  Tris(×4)			1.5ml
  H2O				2.7ml
  1.5% APS			0.3ml
  TEMED			6.0μl
				total 6.0ml

【Separation Gel 12.5%】
  30% acrylamide		2.5ml
  Tris(×4)			1.5ml
  H2O				1.7ml
  1.5% APS			0.3ml
  TEMED			6.0μl
				total 6.0ml

【Tris(×4)】
  Tris			91g
  HCl				pH8.8
  SDS				2.0g
  H2O				total 500ml
   ※1.5M Tris(pH8.8)、SDS 0.4%溶液となる。


【Stacking Gel 4.0%】
  30% acrylamide		270μl
  C.Solution			500μl
  H2O				1.12ml
  1.5% APS			100μl
  TEMED			10μl
				total 2.0ml


【Running Buffer(×10)】
  Tris			30.3g
  glycine			144.1g
  SDS				10g
  H2O				total 1000ml


【Staining Solution(染色液)】
  Coomassie brilliant blue R-250	2.5g
  acetic acid				100ml
  methanol				500ml
  H2O					total 1000ml


【Destaining Solution(脱色液)】
  acetic acid				75ml
  methanol				50ml
  H2O					total 1000ml





 acrylamideは神経毒なので溶液を扱うときは注意する。


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